PCO FLIM技術(shù)助力化學(xué)和微流控研究（1）：pco.flim相機(jī)成功用于DAOTA pH值感測(cè)
Background-free fluorescence decay time sensing and imaging of pH with highly photostable diazaoxotriangulenium dyes
高耐光性重氮雜氮染料pH值的無(wú)背景熒光衰減時(shí)間感測(cè)和成像
Irene Dalfen, Ruslan I. Dmitriev, Gerhard Holst, Ingo Klimant, Sergey M. Borisov
Anal. Chem. 2019, 91, 1, 808–816
Publication Date:December 6, 2018
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b02534
摘要翻譯
文章報(bào)道了一種用于基于壽命的自參考pH值感測(cè)的新型熒光二氮雜三棱（DAOTA）pH指示劑。DAOTA染料用酚類受體基團(tuán)修飾，通過(guò)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制誘導(dǎo)熒光猝滅。吸電子氯取代基確保在最相關(guān)的pH值范圍內(nèi)響應(yīng)（p，p-二氯苯酚和p-氯酚取代染料的表觀pK'a值分別為~ 5和7.5）。這些染料具有較長(zhǎng)的熒光壽命（17-20 ns）、高量子產(chǎn)率（~ 60 %）和高光穩(wěn)定性。將染料固定在聚氨酯水凝膠D4中制備平面光電極。除了對(duì)熒光強(qiáng)度的響應(yīng)外，光電極還表現(xiàn)出依賴于pH的壽命行為，這使得它們適合借助熒光壽命成像技術(shù)研究2D pH分布。對(duì)于具有高染料濃度（相對(duì)于聚合物為0.5-1 % wt.）的傳感器而言，壽命響應(yīng)尤其顯著，并歸因于有效的均勻熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制。
關(guān)鍵詞：衰減時(shí)間，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，pH傳感器，三角藻，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，頻域FLIM
圖文節(jié)選（1）
圖5:D4（1 % wt）中基于PhOHCl2-DAOTA的平面光電極pH的FLIM成像。（a） ：顯微成像實(shí)驗(yàn)中獲得的熒光壽命的pH依賴性（讀出區(qū)～ 0.9 x 0.9毫米）。金屬箔已在室溫下測(cè)量≥ 每個(gè)pH值有3個(gè)不同的點(diǎn)。（b） ：帶有集成傳感器箔的微流控芯片的照片圖像。（c） 和（d）：使用pH 6.5和5.0的緩沖液（速度21 μL min-1）同時(shí)沖洗的微流控芯片的衰變時(shí)間和pH分布的偽彩圖像
圖文節(jié)選（2）
使用PCO（www.pco.de）的pco.flim相機(jī)在頻域內(nèi)進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。激發(fā)源Omicron（www.Omicron-laser.de）的488 nm激光二極管（PhoxXplus 488-200用于pco.flim），以15 MHz調(diào)制頻率（方波調(diào)制）進(jìn)行調(diào)制。平均激光功率為100 mw。Nikon的NIS Elements AR顯微鏡軟件用于數(shù)據(jù)采集和處理。對(duì)于顯微鏡測(cè)量，從傳感器箔上切下直徑為5 mm的傳感面積，并將其粘在Greiner bio one（www.gbo.com）的一個(gè)黑色96微孔板上。使用配備尼康Plan Apo 20x/0.75物鏡和安裝在相機(jī)上的0.7x相機(jī)適配器的尼康Eclipse Ti-S顯微鏡獲取圖像。濾塊兒包括一個(gè)激發(fā)帶通濾波器FF02-482/18、一個(gè)二向色鏡Di02-R488和一個(gè)發(fā)射長(zhǎng)通濾波器BLP01-488R，均來(lái)自Semrock（www.Semrock.com）。使用Starna Scientific（www.Starna.com）的染料摻雜樣片UMM/SFG作為壽命標(biāo)準(zhǔn)（τ=3.75 ns）……為了證明傳感器的實(shí)際適用性，我們使用一種新的頻域壽命成像相機(jī)pco.flim對(duì)其進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)調(diào)查。在成像實(shí)驗(yàn)（圖5a）和TCSPC（圖4）中獲得的熒光衰減時(shí)間的pH依賴性相似。放置在微流控芯片（圖5b）腔室中的平面光電極被證明非常適合監(jiān)測(cè)pH梯度（圖5c和5d）。這可能有用，例如，用于監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)和等電聚焦。該實(shí)驗(yàn)還表明，平面光電極與FD-FLIM相機(jī)結(jié)合也可用于宏觀上的其他實(shí)驗(yàn)，例如監(jiān)測(cè)生物膜或傷口愈合期間的pH值。
關(guān)于pco.flim
pco.flim相機(jī)系統(tǒng)是第一種采用Two-Tap CMOS成像芯片的熒光壽命成像相機(jī)。相機(jī)的像素和激發(fā)光間的同步使100皮秒至100微秒間的熒光衰減時(shí)間的分析成為可能。在1008 x 1008像素分辨率上，pco.flim最多可以讀取45個(gè)雙幀/秒，且可支持5 kHz – 40 MHz頻率范圍的調(diào)制。
基本參數(shù)：
pco.flim激光器作為落射熒光測(cè)量的光源
可選擇的激光波長(zhǎng)和輸出功率
100 ps到100 μs的壽命測(cè)量
調(diào)制頻率從5千赫茲到40兆赫
500千赫茲到40兆赫外部調(diào)制信號(hào)
正弦/矩形的調(diào)制信號(hào)波形
像素分辨率1008 x 1008
頻域FLIM
USB 3.0接口
量子效率39 %
動(dòng)態(tài)范圍1000:1
45 雙幀/秒 (2 tap讀出)
可選曝光時(shí)間為1 ms到2 s
無(wú)振動(dòng)水冷
特殊的測(cè)量與分析軟件
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【關(guān)于PCO】
PCO的字義正是基于我們的角色：Pioneer in Cameras and Optoelectronics – 相機(jī)和光電技術(shù)的先鋒。
經(jīng)過(guò)30年專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)的積累，PCO已被打造成科研和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域中數(shù)碼相機(jī)的前沿專家和創(chuàng)新者，其產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、物理科學(xué)、高速成像和機(jī)器視覺(jué)。
我們擁有市場(chǎng)上最豐富的sCMOS相機(jī)序列，具有全球認(rèn)可的開(kāi)發(fā)各種技術(shù)領(lǐng)先、性能優(yōu)良、型號(hào)廣泛的相機(jī)系統(tǒng)的實(shí)力。我們?cè)谑澜绺鞯氐臋C(jī)構(gòu)和伙伴保證PCO相機(jī)的研制和支持能夠滿足用戶的應(yīng)用。我們的產(chǎn)品研制和支持團(tuán)隊(duì)可以直接采納用戶意見(jiàn)。我們?cè)诋a(chǎn)品硬件和軟件上的不斷前進(jìn)，支撐了我們強(qiáng)大的創(chuàng)新力量和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)力。
【關(guān)于Excelitas Technologies Corp.】
Excelitas Technologies Corp.是科技領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者，提供高性能、市場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的光子創(chuàng)新產(chǎn)品，滿足全球客戶對(duì)照明、光電、探測(cè)和光學(xué)技術(shù)的需求。Excelitas Technologies Corp.服務(wù)于汽車、消費(fèi)品、國(guó)防和航空航天、工業(yè)、醫(yī)療、安全和安防以及科研領(lǐng)域的眾多應(yīng)用，致力于促進(jìn)客戶取得成功。我們的團(tuán)隊(duì)由 7,000 名專業(yè)人員組成，他們?cè)诒泵?、歐洲和亞洲工作，為全球客戶提供服務(wù)。